PCR
PCR är en metod som används för att tillverka många kopior av en viss DNA-sekvens, till exempel en gen.
Sammanfattning
PCR är en förkortning av engelskans Polymerase Chain Reaction och är en metod för att tillverka många kopior av en DNA-sekvens in vitro. På svenska kallas det ibland för polymeraskedjereaktion. En PCR föregår ofta andra genetiska analyser eftersom det är lättare att till exempel sekvensbestämma DNA som finns i tusentals kopior i stället för några få.
PCR imiterar cellens DNA-replikation
Varje gång en cell delar sig kopieras allt DNA i cellen. Det kallas för DNA-replikation och är en förutsättning för att alla celler ska ha samma genetiska information. Det är också en förutsättning för att avkommor ska ärva föräldrars DNA. Man kan säga att PCR-metoden är en efterhärmning av cellens kopieringsmaskin.
Så här fungerar PCR
Vid PCR blandas olika komponenter i en reaktionslösning. Reaktionen startar när blandningen utsätts för upprepade temperaturväxlingar i en PCR-maskin, även kallad termocykler. Efter några timmar har den ursprungliga DNA-sekvensen kopierats hundratusentals gånger.
Komponenterna till reaktionen blandas
- DNA templat kallas den mall som används vid för tillverkningen av kopior. Det är DNA som isolerats från ett biologiskt prov, t.ex. blod eller saliv från den individ som ska analyseras.
- Primers kallas de korta bitar av DNA, DNA-oligonukleotider, på omkring 20 nukleotider, som binder i 3´-ändan på respektive DNA-sträng och därmed omger den DNA-sekvens som ska kopieras. Ett primerpar designas digitalt inför en ny PCR så att de endast binder till den DNA-sekvens som ska kopieras och inte någon annanstans i genomet. Primers kan beställas och köpas av specifika företag som tillhandahåller oligonukleotider med de sekvenser man angivit.
- Fria nukleotider i form av deoxynukleotider (förkortas dNTPs) som är byggstenarna i de nya DNA-sekvenserna. dNTP en mix av dATP, dTTP, dGTP och dCTP. Under reaktionen frigörs byggstenarna adenin (A), tymin (T), guanin (G ) och cytosin (C) ur dessa.
- Det värmetåliga enzymet DNA-polymeras är själva motorn i reaktionen och sammanfogar de fria nukleotiderna till nya kopior av den del av DNA-sekvensen som pekas ut av primerparet. Ofta är det Taq-polymeras med ett temperaturoptimum på 72 grader.
- Reagenserna blandas i en buffert med optimal kemisk miljö för DNA-polymeraset att verka i.
Reaktionen startar i en termocykler
Blandningarna placeras i en termocykler och ett ”PCR-program” startas med upprepade uppvärmningar och nedkylningar. Programmen ser lite olika ut, framförallt temperaturen vid hybrideringssteget kan variera beroende på primerparets sammansättning (till exempel hur många G och C).
Denatuering (94-100 grader C)
De två strängarna i DNA-spiralen separeras för att tillgängliggöra DNA-sekvensen för primers och DNA-polymeras.
Hybridisering (50-68 grader C)
De två primers som används fäster vid sidorna av det DNA som ska kopieras. Temperaturen varierar och beror på primerparets sammansättning av nukleotider. En större andel G och C relativt A och T i primern gör att den behöver en högre temperatur, till exempel.
Elongering/Förlängning (72 grader C)
DNA-polymeraset tillverkar nya kopior av DNA-sekvensen och använder primers som startposition. Byggstenarna är fria nukleotider (dNTPs).
Temperaturcykeln upprepas 25-40 gånger och de nya kopiorna fungerar som nya templat. Till slut har miljontals kopior av samma DNA-sekvens tillverkats. Dessa kan sedan analyseras vidare, exempelvis sekvenseras, eller användas i rekombinant DNA.
Referenser
- Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Jackson RB. Campbell Biology. 10th ed. Harlow: Pearson; 2014.