Fakta
Aktivera ordförklaringar

Genomredigering

Gentekniken CRISPR/Cas9 kallas även för gensax och används för att ändra DNA via inducering av mutationer. Det kallas för genomredigering.

Sammanfattning

Den mest använda tekniken för genomredigering är CRISPR/Cas9. Tekniken gör det möjligt att inducera genetiska förändringar (mutationer) på specifika platser i genomet. Genomredigering används brett inom bland annat forskning, bioteknik, växtförädling, djuravel och medicin, och har resulterat i många produkter och forskningsframsteg. CRISPR/Cas9 har också vidareutvecklats i form av tekniker som basredigering och prime-redigering.

CRISPR/Cas9 är en genteknik för att klyva DNA i mycket specifika sekvenser. Ett guide-RNA ger sekvens-specificitet till nukleaset Cas9 som klyver DNA. Illustration Gunilla Elam.

Så här fungerar tekniken CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 utgörs av ett guide-RNA och enzymet Cas9.

  • Ett guide-RNA är en 20 baser kort RNA-sekvens som binder komplementärt (basparar) med den DNA-sekvens man vill ändra, till exempel en bit av en gen. Forskaren designar och låter tillverka ett nytt guide-RNA till varje unik redigering.
  • Enzymet Cas9 är ett endonukleas som klipper i DNA. Det består av flera olika domäner som har olika funktioner. Guide-RNA är integrerat med Cas9 och bestämmer var Cas9 ska klippa DNA-strängarna.

Steg 1. Cas9 söker igenom DNA

Enzymet Cas9 söker igenom DNA efter en kort sekvens som kallas för en PAM-sekvens (protospacer adjecent motif). För Cas9 är PAM-sekvensen NGG, där ”N” kan vara vilken kvävebas som helst (A, C, T, G) och de två sista är G. När Cas9 hittar en PAM stannar det upp.

Cas9 känner igen en PAM-sekvens. Illustration Gunilla Elam.

Steg 2: Guide-RNA försöker baspara

När Cas9 hittar en PAM-sekvens så öppnar enzymet upp DNA-spiralen så de två DNA-strängarnas baser exponeras. Därefter försöker guide-RNA att binda till de exponderade DNA-sekvensen intill PAM med komplementär basparning.

Cas9 öppnar DNA-spiralen vid PAM och guide-RNA försöker baspara. Illustration Gunilla Elam.

Steg 3: Alla 20 baser i RNA måste matcha DNA-sekvensen

Om inte alla baser i guide-RNA binder till DNA-sekvensen så släpper Cas9 och letar vidare efter nästa PAM.

Guide-RNA basparar med DNA-strängen intill PAM. Illustration Gunilla Elam.

Steg 4: Cas9 klyver

Om alla kvävebaser i guide-RNA matchar och binder till DNA-sekvensen vid PAM så klyver Cas9 den dubbla DNA-strängen. Klyvningen görs tre baser uppströms (5´) om PAM. Om guide-RNA inte matchar så stängs DNA-strängarna och Cas9 letar vidare efter en ny PAM-sekvens.

Cas9 klyver båda DNA-strängarna om guide-RNA basparar. Illustration Gunilla Elam.

Steg 5. I lagningen av klippet uppstår en mutation

När DNA-strängarna skadas aktiveras cellens reparationssystem. Det är nu själva genomredigeringen sker.

Om lagningen skulle bli perfekt och precis som innan klyvningen (utan ny mutation), kan Cas9 klyva samma plats igen. Först när lagningen orsakar en mutation matchar inte längre guide-RNA och känns inte längre igen av enzymkomplexet.

Eukaryota celler har två olika reparationsmekanismer som i sin tur kan leda till olika typer av mutationer: icke-homolog sammanfogning och homologistyrd reparation.

Icke-homolog sammanfogning

Den vanligaste reparationen som cellerna gör vid ett dubbelsträngsbrott kallas icke-homolog sammanfogning (eng. non-homologous end-joining, NHEJ). Vid den här typen av reparation sammanfogas de klyvda DNA-strängarna som en quick-fix. Det är väldigt riskabelt för cellen att DNA skadas, så det är viktigt att lagningen utförs snabbt.

Vid lagningsmekanismen icke-homolog sammanfogning klistras DNA-ändarna ihop igen och det är inte ovanligt att lagningen ger upphov till en sekvensändring. Illustration Gunilla Elam.

Mutationen som uppstår vid icke-homolog sammanfogning kan vara en insertion där baspar tillkommer, eller en deletion där baspar försvinner.

Om mutationen uppstår i en gen förskjuts genens läsram, vilket snabbt leder till ett stoppkodon. Resultatet blir att genen inte längre ger upphov till ett fungerande protein.

Homologistyrd reparation med mall

Den andra reparationsmekanismen kallas homologistyrd reparation (eng. homology directed repair, HDR) och är betydligt mindre vanlig. Här ges forskaren tillfälle att styra vilken mutation som ska uppstå i lagningen genom att med CRISPR/Cas9 föra in en mall (donator-DNA) som används vid lagningen.

Homologistyrd reparation kan bara ske under visa faser av cellens cykel (de så kallade G2 och S-faserna). Det gör att forskaren måste optimera förhållandena i cellen för att den reparationsmekanismen ska aktiveras.

Vid den homologistyrda reparationsmekanismen kan forskaren tillföra en DNA-mall som fungerar som vägledning för lagningen. Därmed blir det möjligt att styra vilken mutation som uppstår. Illustration Gunilla Elam.

Så här fungerar CRISPR/Cas9 i bakterier

Förlagan till tekniken CRISPR/Cas9 finns hos bakterier och arkeér. Hos dem fungerar enzymkomplexet som ett försvar mot infekterande virus, så kallade bakteriofager.

CRISPR/Cas9, som var först med att omvandlas till en genteknik, upptäcktes i bakterien Streptococcus pyogenes. Men det finns CRISPR/Cas-system i de flesta bakterier och arkéer, och en del använder andra enzym än Cas9. De olika systemen kan ha olika egenskaper och uppgifter.

Streptococcus pyogenes. Bild från Wikipedia Commons.

Ett försvarssystem i bakterier och arkéer

När en bakterie eller infekteras av ett virus så injicerar viruset sitt genetiska material i cellen. Bakterien börjar då att tillverka virus-proteiner som sätts samman till nya virus som kan döda bakterien och spridas vidare.

Som en försvarsmekanism har en del bakterier (och arkeér) utvecklat systemet CRISPR/Cas som fungerar som ett immunförsvar och kan identifiera och klippa sönder virusets DNA när det kommer in i cellen.

En finess är att små bitar virus-DNA sparas av bakterien och fogas in i bakteriens eget genom. Det fungerar som ett genetiskt minne. CRISPR/Cas9 har fått sitt namn på grund av att själva sekvensens struktur i bakteriens genom där minnet finns. CRISPR är en förkortning av engelskans Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, och indikerar att sekvensen består av korta repeterade sekvenser som kan läsas lika från båda håll.

Steg 1: Cas1/Cas2 identifierar och sparar virus-DNA

Första gången en bakterie infekteras av ett virus kan det upptäckas av två kopplade Cas-enzymer, Cas1 och Cas2. De letar efter DNA-sekvenser som inte finns i bakteriens eget genom, så kallade PAM-sekvenser.

När DNA från virus identifierats klipper Cas1 och Cas2 ut en liten bit DNA precis bredvid PAM-sekvensen och kilar in den i bakteriens eget genom. Den lilla sekvensen virus-DNA kallas för en spacer.

Enzymerna Cas1 och Cas2 kan identifiera virus-DNA i bakterien och spara små bitar av det i bakteriens genom. Illustration Gunilla Elam.

Varje spacer (S) omges av repeats (R). I en bakteries genom kan det finnas en till flera hundra spacers som bygger upp det genetiska minnes-biblioteket CRISPR. När en bakterie förökas genom delning så följer CRISPR-biblioteket med.

Steg 2: crispr-RNA bildas

När CRISPR i bakteriernas genom läses av vid transkriptionen bildas ett enda långt RNA som kallas pre–crisprRNA. Cas-enzymer klipper sedan upp det i mindre unika RNA-molekyler som kallas för crispr-RNA (crRNA), en molekyl för varje spacer.

De angränsande sekvenserna (R) är palindrom och översätts till den del av crispr-RNA som utgör ”hårnålen” eller ”öglan”. De består av några baser som efterföljs av baser som är komplementära till de första – fast baklänges. Hårnålens funktion är bland annat att ge crispr-RNA stabilitet.

Varje unikt crispr-RNA baseras på en spacer och känner igen ett visst sorts virus. När det kopplas samman med ett Cas, till exempel Cas9 så cirkulerar komplexet runt i bakterien i jakt på virus-DNA.

Steg 3: igenkänning och nedbrytning av virus-DNA

Cas letar efter en PAM-sekvens och öppnar upp DNA-spiralen för crispr-RNA som försöker baspara. Om crispr-RNA matchar med DNA-sekvensen så är det virus-DNA, och då klyver Cas-enzymet.

När Cas identifierar en PAM så försöker crispr-RNA att baspara. Om det lyckas klyver Cas virus-DNA som sedan bryts ner i cellen. Illustration Gunilla Elam.

Olika Cas-enzymer klyver olika. Cas9 gör till exempel ett enkelt klipp medan enzymet Cas3 fungerar mer som en gräsklippare som kör över och klipper sönder en längre sekvens. Resultatet är det samma, viruset elimineras.

Från bakterier till Nobelpris

Forskarna bakom tekniken CRISPR/Cas9 heter Jennifer Doudna och Emmanuelle Charpentier. Fler har studerat CRISPR-system och kommit med viktiga pusselbitar, men det var den här duon som översatte försvarsmekanismen hos bakterier till en teknik.

År 2011 upptäckte Emmanuelle Charpentier en tidigare okänd molekyl, tracrRNA, när hon studerade bakterien Streptococcus pyogene. Hon kunde visa att tracrRNA är en viktig del av bakteriens CRISPR/Cas9-system.

Tillsammans med ett CRISPR-RNA (crRNA) bildar tracrRNA en igenkänningsmolekyl som leder Cas9 till rätt DNA-sekvens. Upptäckten blev en viktig grund för utvecklingen av CRISPR/Cas9 som teknik. I andra CRISPR/Cas system hos bakterier behövs inte tracr-RNA, därför finns det inte med i bilderna ovan som visar hur CRISPR fungerar i bakterier.

År 2020 mottog Emanuelle Charpentier och Jennifer Doudna Nobelpriset i kemi för sitt arbete med att omvandla CRISPR/Cas9 till en genteknik. Bild från Depositphotos.

Samma år som Charpentier publicerade upptäckten om tracrRNA inledde hon ett samarbete med Jennifer Doudna. Tillsammans lyckades de få CRISPR/Cas9 att fungera även utanför bakterien, i ett provrör, och förenklade systemet genom att koppla ihop tracrRNA och crRNA till ett guide-RNA.

I ett epokgörande experiment visade de att CRISPR/Cas9 kan användas för att ändra (redigera) valfri DNA-sekvens i vilken organism som helst. De hade därmed utvecklat ett verktyg för skriva om livets kod på ett mycket precist sätt. År 2020 fick de Nobelpriset i kemi för sitt arbete.

Andra CRISPR/Cas-system

Det CRISPR/Cas-system som har utforskats och använts flitigast är helt klart CRISPR/Cas9 som har sitt ursprung i bakterien Streptococcus pyogenes – men det finns fler. En viktig skillnad är att olika Cas-enzym har olika PAM-sekvenser.

Här följer några exempel på fler CRISPR/Cas-system:

  • CRISPR/Cas12a som finns i bakterien Francisella novicida har endast crisprRNA och inte tracrRNA, vilket gör att guide-RNA är mindre när det översätts till en teknik.
  • CRISPR/Cas13 som finns i bakterien Leptotrichia shahii klyver RNA istället för DNA.
  • CRISPR/Cas3 finns i flera arter av bakterier och gör inte bara ett klipp i DNA-spiralen utan raderar en lång DNA-sekvens.

Basredigering för enstaka förändringar

I en vidareutveckling av CRISPR/Cas9 som kallas basredigering så har Cas9 inaktiverats så att det inte längre klipper av den dubbla DNA-strängen. Det kallas då dCas9 som en förkortning av engelskans dead Cas9.

dCas9 har även genetiskt kombinerats med andra enzym, till exempel enzymet cytosin-deaminas som har förmågan att kemiskt modifiera specifika baser i DNA. Via guide-RNA för dCas9 det här enzymet till en specifik sekvens i genomet där sekvensen kan ändras. En sådan här basredigerare kan till exempel ändra basparet G-C mot basparet T-A, utan att klippa upp DNA-spiralen.

Med tekniken basredigering kan enstaka baspar ändras utan att DNA-spiralen klyvs. Illustration Gunilla Elam.

Prime-editing ger instruktioner

Med en teknik som saknar svenskt namn, och som på engelska kallas prime-editing, klyver
Cas-enzymet endast en av DNA-strängarna. Kopplat till CRISPR/Cas9 finns också enzymet omvänt transkriptas, som kan skriva in ny genetisk information direkt i DNA.

Systemet styrs av ett särskilt guide-RNA som kallas pegRNA (prime editing guide RNA), som både visar var förändringen ska ske och innehåller instruktionen för den önskade DNA-sekvensen.

Äldre tekniker för genomredigering

De första gensaxar som utvecklades kom på 1990-talet och baseras på enzymer som heter meganukleaser och zinkfingernukleaser (ZNF). Efter 2009 började även gensaxen TALEN (förkortning av transcription activator-like effector nucleases) användas men under det senaste decenniet har CRISPR/Cas9 totalt dominerat.

Liksom för CRISPR/Cas9 baseras TALEN och ZFN på nukleaser som klipper i DNA och cellens reparationssystem aktiveras. En mutation uppstår vid lagningen. Ett nukleas måste vägledas av en annan molekyl för att kunna vara användbara. För CRISPR/Cas9 är den vägledande molekylen ett guide-RNA.

Meganukleaser

Meganukleaser är kompletta gensaxar som finns naturligt hos bakterier men även hos en del alger, jästsvampar och ett fåtal växter. De består av en del som känner igen och binder till en specifik DNA-sekvens, och en enzym-del som klipper itu samma sekvens.

Flera hundra meganukleaser har upptäckts och renats fram, men de används inte i samma utsträckning som andra tekniker. Anledningen är att det har varit svårt för forskare att programmera om dem så att de binder till andra DNA-sekvenser än sina ursprungliga. Det innebär att antalet platser i genomet som kan redigeras är begränsade.

ZNF och TALEN

ZFN och TALEN är båda tekniker där ett nukleas satts ihop med en vägledande molekyl på konstgjord väg. Likt meganukleaser består de av två delar, en del som binder till DNA och en enzym-del som klipper itu DNA-spiralen.

För varje ny genomredigering som en forskare vill göra så måste den DNA-bindande delen designas om för det specifika ändamålet. Sedan måste den delen sättas ihop med enzym-delen. ZNF och TALEN är mycket användbara gensaxar men mindre flexibla än CRISPR/Cas9. Det beror på att den DNA-igenkännande delen baseras på protein-domäner som inte är triviala att designa och tillverka, till skillnad från guide-RNA:t hos CRISPR/Cas9.

Referenser

Mer inom samma ämne