DNA-sekvensering

Sammanfattning

De senaste tjugofem årens snabba teknikutveckling har gjort det möjligt att sekvensera en organisms hela genom på bara några timmar. Med hjälp av sekvensering kan forskare bland annat studera enskilda gener, jämföra DNA mellan olika arter samt undersöka samband mellan gener, egenskaper och sjukdomar. Dagens metoder kallas ofta Next Generation Sequencing (NGS), men de första sekvenseringsmetoderna, som Sangersekvensering, utvecklades redan på 1970-talet.

Sangersekvensering

Under 1970-talet utvecklades två olika metoder för DNA-sekvensering. Den som fick störst genomslag var Sangersekvensering, uppkallad efter upphovsmannen Frederick Sanger. Metoden, i utvecklad form, används fortfarande i många laboratorier och passar särskilt bra för att analysera enstaka gener och mutationer.

Vid Sangersekvensering används det DNA som ska undersökas som mall för att tillverka nya DNA-kopior. Dessa kopior innehåller märkta nukleotider med kvävebaserna A, T, C och G. Förr i tiden var nukleotiderna radioaktivt märkta, idag används en annan teknik där varje bas är kopplad till en specifik fluorofor.

En fluorofor avger ljus med en bestämd våglängd när den belyses. Eftersom varje kvävebas är märkt med en fluorofor som lyser i olika färger kan forskarna avgöra i vilken ordning baserna förekommer i DNA-sekvensen. Resultatet visas som ett färgat kromatogram där varje topp motsvarar en kvävebas.

Så här går det till steg för steg

Processen kan delas in i tre huvudsakliga steg.

Steg 1. Reaktionsblandningarna bereds

Fyra olika reaktionsblandningar bereds som vardera innehåller:

1. DNA (templat) som ska sekvensbestämmas.
2. Primer som basparar till början av den del av DNA-sekvensen som ska bestämmas.
3. DNA-polymeras, enzymet som tillverkar den nya DNA-sekvensen.
4. Nukleotider av två typer:
   1. dNTPs (deoxynukleotidtrifosfater) som är de vanliga byggstenarna i DNA
   2. ddNTPs (di-deoxynukleotidtrifosfater) som är märkta med fluoroforer

Alla fyra reaktionsblandningarna innehåller dNTPs, medan varje blandning endast innehåller en typ av ddNTP: antingen ddATP, ddTTP, ddGTP eller ddCTP.

Steg 2. Nya DNA-strängar tillverkas

Reaktionsblandningarna placeras i en termocykler där de genomgår upprepade temperaturcykler.

I varje cykel sker tre steg:

1. Denaturering (94 grader C): DNA-strängarna separeras.
2. Hybridisering (55 – 68 grader C): Primrern binder sin komplementära DNA-sekvens.
3. Elongering (72 grader C): DNA-polymeraset bygger en ny DNA-sträng DNA genom att koppla ihop nukleotider i rätt ordning (som i templatet).

De inmärkta nukleotidernas (ddNTPs) viktiga roll

De märkta nukleotiderna, ddNTPs, förekommer i mycket lägre koncentration än de vanliga dNTPs och skiljer sig från dNTPs på två avgörande sätt:

1. De avslutar DNA-syntesen
   Eftersom ddNTPs saknar en hydroxylgrupp (OH) kan DNA-polymeraset inte koppla på fler nukleotider efter att en ddNTP byggts in. DNA-strängen slutar därför växa när en ddNTP infogas.
2. De är färgkodade
   Varje typ av ddNTP är kopplad till en fluorofor som avger ljus med en specifik våglängd. Därför kan A, T, C och G skiljas åt när sekvensen avläses.

Resultatet blir en blandning av DNA-fragment med olika längd. Varje fragment avslutas med en fluorescensmärkt nukleotid som visar vilken kvävebas som finns på fragmentets sista position.

Steg 3. Sekvenserna sorteras och analyseras

DNA-fragmenten separeras efter storlek med elektrofores. De kortaste fragmenten passerar detektorn först och de längsta sist. När fragmenten passerar registreras fluorescensen från den sista nukleotiden i varje fragment.

Datorn omvandlar signalerna till ett kromatogram, där varje färgad topp motsvarar en kvävebas. Genom att läsa topparna i ordning kan DNA-sekvensen bestämmas.

Tekniken har utvecklats så det idag är möjligt att blanda allt i ett och samma provrör i stället för fyra separata, och avläsa resultatet från fluorescens-detektorn som ger information om den våglängd fragmenten som sorteras i storleksordning avger.

Storskalig sekvensering

Next Generation Sequencing (NGS) är en modern sekvenseringsteknik som gör det möjligt att analysera miljontals DNA-fragment samtidigt. Metoden används bland annat för att sekvensera hela genom, alla exoner i en organism eller utvalda genpaneler.

I stora drag går NGS till så här:

1. DNA isoleras.
2. DNA delas upp i mindre fragment.
3. Fragmenten förses med adaptersekvenser och binds till en fast yta (till exempel en flödescell)
4. Fragmenten kopieras upp så att många identiska kopior bildas.
5. Alla fragment sekvenseras parallellt.
6. Den insamlade informationen omvandlas till digitala DNA-sekvenser.

De korta sekvenserna, vanligtvis 100-200 baspar långa, sammanfogas sedan med hjälp av datoralgoritmer till längre sekvenser. För att öka säkerheten sekvenseras varje kvävebas flera gånger. Antalet gånger en bas läses av kallas sekvenseringsdjup (sequencing depth). Ju högre sekvenseringsdjup, desto säkrare blir resultatet.

Referensgenom är en viktig resurs

En viktig resurs vid sekvensering är att det finns ett referensgenom. Det är en digital sekvens som representerar alla kvävebaser i en arts genom i rätt ordningsföljd och där bland annat artens gener finns markerade.

När en forskare sekvenserar DNA från till exempel en människa så finns den digitala resursen där som jämförelse. Forskaren kan då få reda på om det DNA som sekvenseras är en gen och i så fall vilken, och om sekvensen innehåller några genetiska varianter som inte finns i referensgenomet.

I andra databaser finns det information om hur vanliga olika genetiska varianter är och om en gensekvens till exempel leder till skillnader i aminosyrasekvensen och proteintillverkningen jämfört med referensen.

Kartläggning av arters genom

Mycket kraft läggs ner för att sekvensera så många arters genom som möjligt och tillgängliggöra de digitala sekvenserna. Idag är nästan 100 000 arters genom sekvenserade och många finns tillgängliga digitalt i öppna databaser.

Det är en oerhört viktig resurs för forskare, dels för att kunna studera enskilda arters genetik, men också för att jämföra olika arter. Till exempel är det via jämförelser av arters genom som forskare förstått att den del av genomet som inte innehåller gener, och som tidigare kallades för ”skräp-DNA”, har viktiga reglerande funktioner.

Pangenom beskriver genetiska diversiteten

Jämförelser av genomsekvenser från flera individer inom en art ger viktiga insikter i den genetiska diversiteten. De visar vilka genetiska sekvenser som är gemensamma för arten och vilka som varierar mellan individer. Ett så kallat pangenom är en sammanställning av den samlade genetiska informationen från flera individers genom. Det omfattar både sekvenser som finns hos alla individer och sådana som bara förekommer hos vissa.

Traditionellt har ett enskilt referensgenom använts för att beskriva en arts arvsmassa. Eftersom ett sådant genom inte fångar hela den genetiska variationen inom arten används pangenom i allt större utsträckning som ett komplement eller alternativ till enskilda referensgenom. De kan bland annat bidra till att identifiera gener och genetiska varianter som har betydelse för egenskaper, exempelvis sjukdomsresistens och anpassning till olika miljöförhållanden.

Referenser

• F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467.
• Satam H., et al. (2023) Next-Generation Sequencing Technology: Current Trends and Advancements. Biology 12(7), 997. (Översiktsartikel på mdpi.com)
• Morneau D. (2021) Pan-genomes: moving beyond the reference. Nature (översikt på nature.com)