Rekombinant DNA-teknik

Enzymer som klipper och klistrar

Rekombinant DNA-teknik baseras på enzymer som kan klippa och klistra i DNA. De enzymer som klyver (klipper) kallas för restriktionsenzymer och härstammar från bakterier.

Det finns ett hundratal restriktionsenzymer med olika egenskaper som används för att klyva DNA. Varje restriktionsenzym har sitt specifika motiv, en viss kombination i DNA-sekvensen som det klyver vid.

Resultatet av klyvningen blir antingen ett rakt klipp, eller ett 3’ eller 5’ överhäng med ”klistriga ändar” som underlättar sammankopplingen mellan nya DNA-sekvenser. Två sekvenser med olika ursprung som klyfts vid samma motiv kan hitta varandra.

Ett annat enzym som heter DNA-ligas försluter (klistrar ihop) den nya kopplingen. Det kallas ligering. DNA-ligas finns hos alla organismer och det som används för rekombinant DNA-teknik har ofta isolerats från bakterier eller virus.

Att klona är att kopiera

Molekylär kloning är ett samlingsnamn för ett antal tekniker som används för att föra in rekombinant DNA i ett replikerande medium, som till exempel plasmider eller virusvektorer. Det man vill åstadkomma är att få många kopior av en gen eller att få genen uttryckt för att tillverka ett protein av intresse.

Så här kan molekylär kloning gå till:

När en gen klonas följs ofta stegen i listan.

1. Isolera DNA, vanligtvis en gen av intresse
2. Restriktionsenzymer används för att klyva DNA, både genen av intresse och en vektor (ofta en plasmid).
3. DNA-ligas sammanfogar genen och vektorn (rekombinant DNA).
4. Transformation, plasmiden förs in i bakterier. Ibland behöver bakterierna göras mottagliga med t.ex. elektroporering eller värmechock för att ta upp nya plasmider.
5. Urval, bakterier med rätt plasmid väljs ut, ofta med hjälp av markörgener t.ex. de med och utan antibiotikaresistens.
6. Kloning, bakterierna delar sig och samtidigt kopieras de rekombinanta plasmiderna.

Transfektion av växt- och djurceller

Eukaryota celler från växter, svampar och djur kan inte kan ta upp DNA spontant så som bakterier kan. Därför har olika tekniker utvecklats för att kunna föra in nytt DNA och genetiskt modifiera eukaryoter. Den processen kallas för transfektion.

En metod som används ofta då forskare modifierar laboratoriemöss genetiskt är mikroinjektion. Då fixeras en befruktad äggcell under ett mikroskop och en mycket tunn glaskanyl används för att föra in en rekombinant plasmid i cellkärnan. Inne i cellkärnan integreras antingen DNA i genomet eller uttrycks transient (inte integrerat men transkriberas likt annat DNA).

Ett annat alternativ är elektroporering som innebär att en kort elektrisk puls skapar små tillfälliga öppna porer i cellmembranet där en rekombinant plasmid eller annat DNA kan slinka in. Används till exempel om det är större plasmider som ska föras in i cellen.

Även lipida nanopartiklar kan användas för att transportera rekombinanta plasmider. Det är mikroskopiska fettbubblor som lämpar sig väl för att transportera mindre molekyler.

Om det är en växtcell som ska modifieras genetiskt kan forskare ta hjälp av jordbakterien Agrobacterium tumefaciens. Det är en bakterie som ibland kallas för ”naturens egna genmodifierare” eftersom den har en speciell förmåga att infektera växter och samtidigt föra in sina gener i växtens genom. Om A. tumefaciens tagit upp en specifik typ av rekombinant plasmid kommer den när den infekterar en växt att integrera rekombinant DNA i växtens genom.